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X連鎖性慢性肉芽腫症(CGD)・常染色体劣性CGD

【監修】
宮崎大学
布井 博幸先生 日高 文郎先生

はじめに

慢性肉芽腫症(chronic granulomatous disease; CGD)は食細胞の活性酸素産生障害を来す遺伝性免疫不全症である。乳幼児期より重症細菌・真菌感染症を反復し、諸臓器に肉芽腫を形成する特徴をもつ。1957年Goodらが本疾患を初めて報告されて以来、活性酸素産生に関わる蛋白質や遺伝子である膜蛋白質gp91phoxが1986年に発見され、その後、その共存膜蛋白としてp22phoxが、また細胞質因子であるp67phox、p47phoxやsmall G蛋白質であるRac p21、さらに食胞内への活性を高めるp40phoxが次々に明らかにされてきた。臨床的にも多くの患者の遺伝子解析が進み、2010年には世界のgp91phox欠損症の1,200名に及ぶ遺伝子解析が報告され、その遺伝子変異から臨床症状の重症度もおよそではあるが推察できるようになってきている。臨床面では、近年、細菌感染症の予防や新しい抗真菌剤の導入で多くの患者が、腎障害をあまり心配せず治療できるようになり、成人まで生存できるようになっている。しかし、一方で、過剰な炎症状態であるCrohn病様腸炎(CGD colitis)や肉芽腫症については、まだ解析が十分でなく、治療にも難渋している。最近の研究では 活性酸素産生障害により抗炎症機構が少なくとも3つの機序で、過剰炎症症状がひきおこされていることがわかってきた。今後、肉芽腫の発症機序についての研究が進み、さらなる病態の理解のもと、新たな対処法が見出されなければならない。
また、根治療法の一つである骨髄移植については、かなり技術も向上し、より安全に実施できるようになってきている。一方、遺伝子治療についてはまだ検討の段階であり、十分な成果はあがっていない。今後、より安全かつ確実な根治療法の確立が望まれている。

原理

食細胞は酸素分子をスーパーオキシド(O2-)にして細胞外または食胞内に放出し、より強い活性酸素(H2O2、OH-、OCl-)となり殺菌に働く。スーパーオキシド産生酵素であるNOXは2つの膜蛋白質(gp91phox、p22 phox)と4つの細胞質蛋白質(p47 phox、p67 phox、p40 phox、Rac p21)の酵素複合体を形成し(図1)、また各々の遺伝子もクローニングされている。CGDでは食細胞の活性酸素産生に関わる主要因子のいずれかが欠損しているためNOX活性が欠損ないし減少する1)

図1 NADPH oxidaseの構成蛋白質

特徴・症状

乳児期より化膿性皮膚炎、リンパ節炎、肺炎、中耳炎、肝膿瘍、肛門周囲膿瘍などを繰り返す難治性細菌または真菌感染症を認める(図2)。

図2 臨床像 胸郭を超えての肉芽腫(左上)は成育医療センター、小林

諸臓器に肉芽腫形成を伴うこともあり、消化管の肉芽腫がCGD患者の約半数に認められると報告されている2)。軽症例では10歳を超えてから発症することもある。gp91 phox遺伝子と隣接遺伝子のXKやRP3の同時欠失を認めるMcLeod症候群は網膜色素変性を合併する。
CGDではスーパーオキシドに続く一連の活性酸素も産生されないことに加え、ブドウ球菌、クレブシエラ菌、大腸菌、カンジダ、アスペルギルスといった非H2O2産生カタラーゼ陽性菌では、活性酸素がどこからも供給されないため殺菌できない。臨床の場でも患者からこれら非H2O2産生カタラーゼ陽性菌が高頻度に検出されるとともに、死亡原因に大きく関与する3)
肉芽腫形成の解析は近年進んで来たので、最新情報(今後の動向)の項で詳しく述べた。

診断

臨床症状や家族歴から本疾患を疑い、活性酸素産生能の欠損を認めることでCGDと診断される。食細胞活性酸素産生能の測定にはNBT色素還元能試験やH2O2を検出する蛍光プローブとしてDCFHやDHR-123を用いたflow cytometry法がある(図3)。

図3 DCFH法とDHR-123法の比較
溶血前に、または溶血後にPMA刺激したもの(溶血前、後反応)した場合の比較

また7D5モノクローナル抗体を用いたcytochrome b558(gp91 phox、p22 phox)発現解析、ウェスタンブロッティング、遺伝子解析から欠損蛋白を確認し、それに基づき病型分類される。保因者診断もこれらの解析によって確定する。

遺伝子解析

CYBB (gp91phox)遺伝子解析は日本及び世界で1200例以上報告された4)。世界ではナンセンス変異がもっとも多く、次いで欠失変異、ほぼ同数でスプライス変異、ミスセンス変異と続いている(表1)。

表1 世界と日本のCYBB遺伝子変異の比較

変異 世界の統計 日本の統計(-2006)
家系数 変異数 患者数 家系数
ナンセンス 377(29%) 96(14.1%) 27(32.9%) 15(25.4%)
欠失 281(22.2%) 242(35.6%) 12(14.6%) 11(18.6%)
スプライス 247(19.5%) 120(17.6%) 15(18.3%) 9(15.2%)
ミスセンス 246(19.4%) 145(21.3%) 19(23.1%) 16(27.1%)
挿入 89(7%) 54(7.9%) 7(8.5%) 6(10.1%)
欠失+挿入 19(1.5%) 19(2.8%) 2(2.4%) 2(3.4%)
プロモータ 8(0.6%) 5(0.7%)    
  1267 681 82 59

Kuhnsらは詳細な検討を行い、残存活性酸素産生活性があると死亡率は優位に低いことが報告されている。また残存活性酸素産生活性はミスセンス変異(His部位を除く)がほとんどであり、309塩基からN末端の部位に多く、C末端には活性が残っていない(図4)と報告している5)

図4 ミスセンス変異の部位と活性(文献5)

骨髄移植や遺伝子治療の適応にもかかわっており、事前に十分な精査が必要だと考えている。c.252C>A変異スプライス異常は世界で44例、日本では7例が診断されている(図5)。

図5 スプライス変異の部位(文献4を図にした)

この変異症例はインターフェロンγに反応し、投与後2~3週間でgp91phoxを20~30%発現する(参考資料)ため、軽症型であると報告している6)
CYBA (p22phox)遺伝子解析では多彩な変異を認め変異部位に優位性を認めない7)
NCF1 (p47phox)欠損型は欧米では約20%を占める。第2エクソンのはじめのGTが欠損しているため、スプライス異常が起こり失活している症例が大部分である7)NCF1遺伝子の前後にはpseudogeneがタンデムに1個ずつ存在しており乗り換えが頻繁に起こっていることが、この変異が多い原因になっていると考えられる8)。なお日本と欧米との頻度の差の原因は不明である。
NCF2(p67phox)遺伝子解析では種々のヘテロな遺伝子変異が示されているが、エクソン5までの変異が多い7)
p40 phox欠損型はこれまで報告がなかったが、最近NCF4遺伝子異常が確認された1例が報告された9)
NCF1,2,3,4,CYBAの変異については図6をご参照ください。

図6 p47phox, p67phox, p40phox,p22phox遺伝子変異と相互作用(文献7より引用)

治療法

一般的な治療方針はST合剤、抗真菌薬などの投与と対症療法である。肉芽腫に対して外科的切除ができる場合はよいが、内科的治療について明確な指針なく、まだ確立されたものはない。平均寿命は25~30歳であるが、最近では抗菌療法の発達およびInterferon(IFN)投与などの医学的進歩とともに生命予後は改善し、30歳以上の患者が増えてきている。

1)日常生活の手引き

治療法や予防法が進んでも日常生活の中で大量の細菌や真菌に暴露されない事が重要である。安心、安全な生活をおくるためにも、日常生活の手引き(宮崎大学小児科ホームページ)を参照いただきたい。

2)予防接種

CGDが細菌・真菌・結核に罹患しやすいことから、予防接種を受けてとくにウイルスに対する免疫をつけておくことは重要である。予防接種のうち結核予防接種であるBCGでは、深在性リンパ節炎(BCGitis)がおこることが知られている。BCGitisでは原発性免疫不全研究会で以下のように治療指針が示されている。

3)IFN-γ

1991年の二重盲検による欧米多施設共同研究でIFN-γがCGDの約1/3の患者で重症感染症の発症を抑制できることが報告された。日本でも患者の約3-4割に投与されているが、その作用機序は未だ明らかではない。我々は同じスプライス異常の遺伝子変異をもった3名の患者でIFN-γが有効な症例を経験した10)。生体内の幼弱な骨髄芽球のmRNAスプライス是正にIFN-γが影響しているものと思われる。またIFN-γがNO産生を亢進させることでapoptotic細胞を貪食できるようになるという報告もある6)

4)抗真菌剤

真菌感染症の予防はCGD患者の予後を左右する重要な因子である。特にアスペルギルス属は肺などに肉芽腫を形成し治療に難渋する症例が多い。
キャンディン系抗真菌剤は主にカンジダに有効であるが、アスペルギルスに対しても有効と考えられている。トリアゾール系抗真菌剤のイトラコナゾールは真菌感染症予防に有効と報告され、ボリコナゾールは腎障害なく使いやすい。これら抗真菌剤が併用されることもある。

5)骨髄移植

肉芽腫を十分に治癒できない症例や臓器障害などによりこれ以上薬物治療を続けることが困難な症例などに実施されてきたが、欧米からの報告では血縁のHLA一致ドナーでないと移植成績が悪い。国内では造血幹細胞移植が1992年から2006年末までに32例の患者に施行されたが、そのうち7名の死亡が報告されたが、徐々に症例が蓄積され良好な成績を上げるようになっている。
骨髄移植例のうちcyclophosphamide(CY)+fludarabine(Flu)前処置では死亡例なかった。今後前処置(図7)だけでなく、ドナーとのマッチング、合併症の有無との関係などさらに詳しい解析が望まれる。

図7 骨髄非破壊的造血幹細胞移植前処置法

現在、広島大学小児科の小林正夫先生の教室で積極的な移植をしていただいているので、ご相談ください。慢性肉芽腫症の骨髄移植症例の登録も一緒に御願いします。

6)遺伝子治療

CGDは先天性免疫不全症の中でも最も患者数の多い疾患であり、根治療法でもある骨髄移植のための前処置にも耐えることが出来ない程悪化している症例もある事から、遺伝子治療の道が模索されていた。1995年、米国立衛生研究所のMalechらによって、p47phox欠損型CGD患者5名に遺伝子治療が行われ、以降は表2の様に進んでいる。

表2 これまでの遺伝子治療まとめ




Center


Patients
treated


Total
conditioning


Vector
type useda

%
Transduction
efficiency
Total dose
of infused
CD34+
cells/kg

Significant
engraftment
>3 months

lnitial
clinical
benefitb



Genotoxicity



Ref
Frankfurt 2 Lipsomal
busulfan,
8.0mg/kg
SF71gp91phox
(SFFV-LTR)
P1:45.0
P2:39.5
P1:11.3×106
P2:9.0×106
15% gene
marking in
CD15+cells
Yes Both patients
developed clonal
myeloproliferation
and MDS with
monosomy7
Stein et al.38,
Ott et al.40
Zürich 1 Liposomal
busulfan,
8.8mg/kg
SF71gp91phox
(SFFV-LTR)
32.3 6.0×106 20% gene
marking in
CD15+cells
Yes Development
of clonal
myeloproliferation
Bianchi et al39
and R. Seger,
personal
communication,
April 2010
London 1

3
Melphalan,
140mg/m2
MFGS-gp91phox
(MLV-LTR)
SF71gp91phox
(SFFV-LTR)
5-20 0.2-10×106 No Yes No A. Thrasher,
personal
communication,
April 2010
NIH 3 Busulfex,
10mg/kg
MFGS-gp91phox
(MLV-LTR)
25-73 18.9-71.0×106 No Yes No Kang et al.37
Seoul 2 Busulfex,
6.4mg/kg+ fludarabine,
120mg/m2
MT-gp91phox
(MLV-LTR)
P1:10.5
P2:28.5
- No Yes No Kim et al.44

以下色々な紆余曲折がありましたので、少し詳しく報告します。
2003~2004年に、ドイツ・フランクフルト大学のOtt博士らは、Grez博士の作製したSF7gp91phoxを用いて8mg/kgのBU前処置を加えたところ、3名中2名までが6~7カ月後から活性をもつ細胞の割合が上昇するとともに、遺伝子マーキングの比率も上昇し10)、世界中から大変注目された。しかし、9カ月後には50%の活性改善をピークに低下し、遺伝子マーキングでは徐々に低下に向かい、遺伝子治療後約2年半目に歯科治療後に敗血症にて死亡したと報告された。この症例では後に保存された血液で遺伝子導入部位の検査(LAM-PCR法)を行うと、MDS/Evi1を含むクローンが認められ、さらに染色体検査でモノソミー7であることが明らかになった。遺伝子導入された挿入部位のLTRのCpG islandのメチル化がすでに560日の資料でかなり進んでおり、遺伝子導入されていても蛋白発現がされていないことを裏づけていた。もう1例も同様に、MDS/Evi1を含むクローンが認められ、同様にLTRのメチル化やモノソミー7も確認されており、骨髄移植の準備が進んでいると報告を受けている11)。3例目については、遺伝子治療により改善した活性酸素産生細胞も、14%に達した後1カ月で減少した。しかし、遺伝子治療3カ月後、脊椎の肉芽腫を伴う四肢麻痺の状態を脱し、歩行が可能になったと報告されている12)。Grez 博士らが使用したSF7gp91phoxベクターにはMyeloid特異的leaderが使用されており、そのことが6~7カ月後からの活性上昇と、その後のMDS/Evi1を有するクローンをより選択的に増殖させた原因ではないかと討論されている11)。また韓国のKim博士らは、独自のレトロウイルスベクターを用いて10mg/kg BUと120mg/kg Flu前処置後に2名の患者に遺伝子治療を実施し、10%, 28.5%の一過性の活性改善と得ている13)
その後、米国のMalech博士は前回の遺伝子治療で使用したMFGS-gp91phoxベクターを用いて10mg/kg BU前処置を加え、3名の患者へ遺伝子治療を試みた。2例の末梢血で25~75%程度の活性の再構築が起こったが、1カ月を過ぎた頃から減少し、1年後には1%くらいの活性が残っていた。その後5年が経過しているが、その活性を維持している。肝心な臨床経過は、短期にはリンパ節膿瘍や肉芽腫の改善が得られ、長期予後としては1%の活性残存にもかかわらず、遺伝子治療前のような感染の繰り返しはないということである14)
CGDの遺伝子治療においても、これまで、いろいろなレトロウイルスベクター系や考案されてきたが、現在、レンチベクターやサイレンシングを受けにくく、より安全で効率的なベクターの開発が進んでいる15)。しかし、前処置の程度や造血幹細胞採取法では一過性の活性上昇は得られ、少なくとも直面した感染症が軽快できそうであることから、骨髄移植に耐えられないような症例については現在行われている遺伝子治療が緊急時の治療として適応になるのではないかと考え、成育医療研究センター(遺伝子治療部長 小野寺先生)でHLAが一致するドナーが見つからない症例を対象に実施する予定になっている。

最新情報(今後の動向)

1)肉芽腫形成の発症機序

CGD患者では食細胞活性酸素産生が欠損するために活性酸素を必要とする細菌真菌の殺菌能が障害されている。この殺菌能欠損に加えて、患者は皮膚、尿管などの肉芽腫形成による障害やCrohn病様の腸炎などの自己炎症症状に悩まされている。近年、細菌感染への予防対策が立てられ、大部分のCGD患者が成人まで生存可能になりつつあるが、過剰炎症症候群または自己炎症症状への対策が十分でないため以前より肉芽腫症やCGD腸炎などの自己炎症症状が目立つようになってきている。
Schäppiらは、 NOX2ノックアウトマウスではAspergillus fumigatus等の真菌細胞膜抽出物であるβ(1–3)(1–6)-グルカンが過剰な炎症をひきおこすことを明らかにし、その消化分解か炎症シグナル系への抑制シグナルが働かずに、デクチン受容体を通じた炎症にシグナルが働き続けることによる炎症細胞の持続的浸潤がおこっていると考えている16)
最近の研究では、慢性肉芽腫症での過剰炎症に関わり、以下の3つの機序が考えられている(図8)。1)患者食細胞では活性酸素が放出されないためscramblaseの活性化が低下し、phosphaticyl serin(PS)が膜表面に表出できず、PS受容体(PSR)を介してのアポトーシス細胞貪食(エフェロサイトーシス)が惹起されず、その結果、抗炎症として働くTGF-β産生が抑制される(図8-右上)17)。2)CGDでは活性酸素依存的なNrf2の核移動が抑制されたり(図8‐右下)、3)活性型caspase-1の失活(図8‐左下)が障害された結果、相対的持続的なnuclear factor(NF)-kBの刺激とcaspase-1の活性化が起こり、サイトカインの持続的で過剰な産生が、肉芽腫という特異的な病理像を形成するのではないかと考えている18)

図8 活性酸素と自然免疫系のかかわり(文献17、18)

2)抗肉芽腫・CGD腸炎治療

上記の肉芽腫形成機序の項でも述べたが、活性酸素が十分産生されないため、炎症抑制機序が十分働かず、炎症が炎症局所で持続する事により、肉芽腫形成や難治性腸炎に苦しむ事になる。CGD腸炎はCGDに合併する炎症性腸疾患様の病態で、50%近くに合併する頻度の高い合併症です。gp91phox欠損型に多いといわれていて、肛門病変、非連続性病変が特徴で、UCよりはクローン病に類似している。抗生剤、抗真菌剤の内服やIFNγ使用とは関連がないといわれている。CGD腸炎はメサラジン投与で軽快する症例から、ステロイド、免疫抑制剤併用療法に反応が乏しい難治性のものまで幅広く存在している。抗TNFモノクローナル抗体(インフリキシマブ)で改善した報告はあるが、感染症での死亡例報告もあり、安易な使用には注意が必要である。抗IL-1モノクローナル抗体(アナキンラ)にて腹痛発作の回数は減少したものの、便回数は変わらなかったという報告もあります。ステロイドとメサラジン、サレド、サリドマイドはIKKα、βを抑制することで、NFκBの活性化とTNFα 、IL6の産生を抑制すると考えられていて19)、CGD colitisに奏功することが報告されている。

参考文献

1)布井博幸:慢性肉芽腫症研究の新たな展開 日本臨床免疫学会会誌 30:1-10, 2007

2)布井博幸、水上智之:慢性肉芽腫症。小児科 50:1140-1145, 2009

3)日高文郎ほか:慢性肉芽腫症の臨床と最近の進歩。小児科46:375-382, 2005

4)Roos D et al. : Hematologically important mutations : X-linked chronic granulomatous disease (third update). Blood Cells Mol Dis 45 : 246-265, 2010

5) Kuhns DB, et al. Residual NADPH oxidase and survival in chronic granulomatous disease. N Engl J Med 2010;363:2600-2610

6) Ishibashi F, et al. Improved superoxide-generating ability by interferon gamma due to splicing pattern change of transcripts in neutrophils from patients with a splice site mutation in CYBB gene. Blood 2001 ; 98:436-441

7) Roos D, et al. Hematologically important mutations: the autosomalrecessiveforms of chronic granulomatous disease (second update) Blood Cells Mol Dis 2010;44:291-299

8) Roesler J, et al. Recombination events between the p47-phox gene and its highly homologous pseudogenes are the main cause of autosomal recessive chronic granulomatous disease.Blood 2000;95:2150-2156

9)J.D. Matute et al. : A new genetic subgroup of chronic granulomatous disease with autosomal recessive mutations in p40phox and selective defects in neutorophil NADPH oxidase activity. Blood 114 : 3309-3315, 2009

10) Ott MG, et al. Correction of X-linked chronic granulomatous disease by gene therapy, augmented by insertional activation of MDS1-EVI1, PRDM16 or SETBP1. Nat Med 2006;12: 401–409

11) Stein S, et al. Genomic instability and myelodysplasia with monosomy 7 consequent to EVI1 activation after gene therapy for chronic granulomatous disease. Nat Med 2010;16: 198–204

12) Bianchi M, et al. Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis. Blood 2009:114: 2619–2622

13) Kang HJ, et al. Retroviral gene therapy for X-linked chronic granulomatous disease: results from phase I/II trial. Mol Ther. 2011 Nov;19(11):2092-101.

14) Kang EM et al. Retrovirus gene therapy for X-linked chronic granulomatous disease can achieve stable long-term correction of oxidase activity in peripheral blood neutrophils. Blood 2010;115: 783–791.

15) Grez M, et al. Gene therapy of chronic granulomatous disease: the engraftment dilemma. Mol Ther 2011; 19: 28–35

16) Schäppi M, et al. Branched fungal beta-glucan causes hyperinflammation and necrosis in phagocyte NADPH oxidase-deficient mice.J Pathol 2008;214:434-444

17) Frasch SC, et al., NADPH oxidase-dependent generation of lysophosphatidylserine enhances clearance of activated and dying neutrophils via G2A. J Biol Chem 2008;283:33736-749

18) Frank L. van de Veerdonk1, Sanne P. et al., Reactive oxygen species–independent activation of the IL-1β inflammasome in cells from patients with chronic granulomatous disease . Proc Natl Acad Sci U S A 2010;107:3030-3033

19) Yasui K, et al., Thalidomide dramatically improves the symptoms of early-onset sarcoidosis/Blau syndrome: its possible action and mechanism. Arthritis Rheum. 2010 Jan;62(1):250-7.

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